半定量pcr 半定量pcr怎么做

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1、PCR注意事项PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

2、阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。

3、寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

4、模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

5、⑤模 板变性不。

6、在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

7、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致阴性。

8、需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

9、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。

10、有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。

11、②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

12、如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

13、③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

14、④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

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